Mecanismos de protección mediados por IgA de la leche materna para combatir los tipos de diarrea por Escherichia Coli

Dra. Magda M.S. Carneiro-Sampaio

Profesor de Inmunología

Instituto de Ciencias Biomédicas

Universidad de Sao Paolo, Brasil

Estudios clínicos y epidemiológicos extensivos han mostrado que la leche materna es efectiva en la reducción de la diarrea infantil y otras enfermedades infecciosas (Jason et al. 1984, Victora et al. 1987, Carlson & Hanson, 1994). La diarrea infecciosa aguda continúa representando una de las causas más comunes de la morbilidad y mortalidad infantil en países en vías de desarrollo (Blake et al., 1993).  

El calostro y la leche contienen los más altos niveles de IgA de todas las secreciones humanas, llegando a 10 a 15 g/l durante la primer semana de lactancia (Hanson & Brandtzaeg, 1973, Barros & Caneiro-Sampaio, 1984). Una de las funciones protectoras de IgA es proporcionar una barrera inmunológica que protege contra sustancias extrañas. Los anticuerpos IgA pueden impedir la adherencia de bacterias a las células epiteliales humanas, así como la adherencia y penetración de virus (Mazanec et al., 1993). Las oligosacáridos que se encuentran presentes en la leche materna pueden también participar e la inhibición de la adhesión bacteriana (Craviotto et al., 1991, Kunz & Rudloff, 1993).

Durante los últimos 8 años hemos estudiado los mecanismos de protección mediados por IgA de la leche humana para combatir las infecciones diarreicas del tipo Escherichia Coli, con énfasis en la E. Coli Enteropatogénico (EPEC), que es el principal agente etiológico de la diarrea infantil aguda en Brasil (Gornes et al., 1991). Algunos de los resultados en este campo se resumen en este artículo.

Las muestras de calostro y leche humana de madres que viven en un área endémica, han mostrado poder inhibir la adhesión de EPEC a las células epiteliales. EPEC causa diarrea acuosa severa sólo al adherirse al epitelio intestinal o producción de toxinas importantes. En la patogénesis EPEC, existe una adherencia inicial a las microvellosidades de los enterocitos, seguido de una adhesión afectando a las microvellosidades (Knutton et al., 1987, Giron et al., 1991, Law 1994, Donnenberg et a., 1997). Para causar una lesión de adhesión/eliminado (A/E), EPEC trastorna las rutas de traducción de señales de las células huésped y explota los componentes de membrana/citoesqueletal del huésped. Entre los factores EPEC asociados con estos virus se encuentran adhesinas y proteínas señaladas de células tales como Intimín, BFP (pilli formadores de grupos) EspD. Las adhesinas 94 kDa llamadas intimín, se adhieren a un receptor intimín trasladado por EPEC (Tir) en las células mucosas intestinales.

Utilizando un modelo clásico in vitro de la adherencia localizada EPEC a células Hep-2 o HeLa, Silva & Giampaglia (1992), mostraron que el calostro humano en grupo inhibe la adhesión de EPEC en células epiteliales humanas cultivadas (células HeLa y Hep-2).

En un estudio secundario observamos que todo el calostro y las muestras de leche 7, 30 y 60 de 39 madres pudieron inhibir la adherencia in vitro de EPEC 0111:H a las células Hep-2. Estas muestras de calostro y leche se obtuvieron de madres sanas y bien alimentadas provenientes de niveles socioeconómicos bajos (algunas habitando en barrios),quienes habían dado a luz bebés de término completo, normales. Una actividad inhibitoria equivalente se observó en muestras de leche y calostro de madres que habían dado a luz niños de bajo peso al nacer, prematuros y pequeños para su término (Delneri et al., 1997).

El calostro y la leche humana contienen anticuerpos IgA reactivos a las proteínas asociadas al virus EPEC

Posterior A ESTA observación inicial, mostramos que la actividad inhibitoria se perdía cuando el calostro se reducía por el IgA (por la técnica de cromatografía de afinidad cefarosa); por otra parte, el eluato enriquecido por IgA resultó ser un inhibidor potente (Cámara et al., 1994). Bajo nuestras condiciones de análisis, la fracción de calostro humano que contenían oligosacaridas no presentaba un efecto de inhibición a la adhesión bacterial a las células Hep-2.

En los experimentos Western-Blotting (WB) con antígenos EPEC de membrana exterior, detectamos anticuerpos IgA en el calostro reactivas a varias proteínas de la membrana exterior de la EPEC. Todas las muestras de calostro y leche de nuestras pacientes reconocieron una banda kDa 94, consistente con el peso molecular de intimín. En estudios más recientes utilizando mutantes de E. Coli o construcciones peT como controles, observamos anticuerpos IgA de calostro reactivas a las proteínas principales asociadas al virus EPEC: Intimín, BfpA, EspA y EspB al igual que anticuerpos anti-Tir (Loureiro et al., 1998, Adu.Bonie et al., 1998, Sanchez et al., 2000).

La persistencia de anticuerpos IgA anti-EPEC en el tracto gastrointestinal neonatal se mostró por la fuerte reactividad hacia intimín en el análisis WB en las heces de un infante de 5 días que se alimentaba al pecho, comparado con el calostro de su madre (Carbonare et al., 1997).

El calostro humano contiene anticuerpos IgA reactivos a E. Coli 0111 LPS

Además de anticuerpos reactivos a las proteínas asociadas con el virus EPEC, también hemos buscado anticuerpos antiliposacáridas en el calostro. El análisis de pares de madres (calostro y suero) y sus recién nacidos (cordón umbilical), detectamos anticuerpos IgA e IgM en muestras de calostro y en muestras de sangre, detectamos IgM  e IgG que reconocen muchas bandas de E. Coli 0111 LPS. Anticuerpos IgA de calostro reconocieron diferentes bandas LPS comparado con los anticuerpos IgG de suero de los mismos individuos. Los análisis ELISA revelaron concentraciones más elevadas de anticuerpos antiendotoxina en muestras de calostro comparado con las muestras de suero de las mismas madres. Utilizando análisis WB y de enfoque isoeléctrico, demostrando claramente la transferencia por medio d la placenta de anticuerpos IgG anti LPS. (Nagao et al., 1998 y 1999).

El calostro IgA humano puede inhibir la invasión de Escherichia Coli enteroinvasiva (EIEC) en las células Hep-2

Después de demostrar que el calostro humano ayuda a prevenir, in vitro, la adherencia de EPEC a las células epiteliales, decidimos investigar si pudiese también, inhibir una invasión celular por EIEC. El riesgo de exposición a EIEC continúa siendo alto en Sao Paolo, especialmente entre los habitantes de los barrios) Toledo & Trabulsi, 1990)

Al igual que Shigella, EIEC invade y se multiplica dentro de las células epiteliales y su habilidad para invadir depende de la presencia de la codificación de una plasmida – 140 mDa para la producción de los polipéptidos de la membrana exterior asociados con el virus, conocidos como antígenos plásmidos de invasión: Ipa A (70 kDa), Ipa B (62 kDa), Ipa C (41 kDa), y Ipa D (37 kDa) (Hale et al., 1985, Pal et al., 1989).

En nuestro estudio, de 77 muestras de calostro re unidas de mujeres viviendo bajo condiciones de mala higiene, 73 (95.9%), pudieron prevenir la invasión de EIEC en células Hep-2 (Carbonare et al., 1995). Los niveles de anticuerpos anti EIEC se midieron por medio de ELISA en estas muestras de calostro y los datos indican una buena relación entre los índices de anticuerpos y la actividad inhibitoria de invasión por bacteria. Además se mostró que IgA en una columna de afinidad por cromatografía, perdió su efecto inhibidor Los análisis de WB se levaron a cabo utilizando extractos antigénicos de una sepa EIEC 029:H invasiva. Probamos muestras de calostro can alta actividad inhibitoria y otras asociadas de baja inhibición. Las proteínas de aproximadamente 78, 62, 43 y 38 kDa, consistentes con Ipas A, B,C,Y D, respectivamente, se reconocieron claramente por muestras de alta inhibición, mientras que no aparecieron bandas o aparecieron bandas muy ligeras en las manchas incubadas con muestras de baja inhibición. Los anti Ipas de anticuerpos IgA del calostro humano pudieran asociarse a la protección contra la invasión EIEC.

IgA del calostro humano puede inhibir la invasión en células Hep-2 por E. Coli enteroagregada (EaggEC)

Hace poco tiempo, observamos la actividad inhibitoria in vitro del calostro humano de las mismas madres en contra de sepas de Escherichia Coli enteroagregada (EaggEC) (Carbonare et al., 1999). Esta inhibición es mediada por anticuerpos IgA reactivos a la proteína de la membrana externa de EaggEC llamada funbria adhesina agregativa (AAF-II), mientras que los anticuerpos de la misma especificidad se observaron en muestras de inhibición nula o baja. EaggEC ha sido reconocida como un enteropatógeno importante y común que causa diarrea persistente y la desnutrición en infantes brasileños (Wanke et al., 1991).

El calostro humano inhibe la adhesión a células Hep-2 de la toxina tipo Shiga que produce E. Coli (STEC)

Los resultados preliminares indican que las muestras reunidas de madres viviendo en Sao Paolo presentaron anticuerpos reactivos a componentes de la cepa STEC y que son capaces de inhibir en gran medida, la adhesión de STEC a las células Hep-2, en niveles equivalentes como las de la inhibición observada en cepas EPEC. Sin embargo el calostro no neutralizó el efecto citotóxico de STx1 y STx2 en células Vero (Palmeria et al., datos no publicados). Anteriormente, se llamaba EHEC (E. Coli enterohemorrágico) a STEC.

Calostro  de una persona saludable deficiente en IgA puede inhibir la adhesión de EPEC y la invasión por EIEC en células Hep-2

Entre las madres estudiadas, encontramos una con deficiencia de IgA (suero de IgG normal, IgG subclase y niveles de IgM y niveles IgA no detectables).Lo sorprendente es que su calostro inhibía ambas, la adherencia de EPEC y la invasión por EIEC a las células Hep-2 en niveles equivalentes a los de un control normal.

Al medir los niveles de inmunoglobulina en sus muestras de calostro, encontramos concentraciones de IgM mucho más elevadas que las de madres normales. En los análisis WB, sus anticuerpos IgM reconocían las mismas bandas de EPEC y de EIEC como lo hacen los anticuerpos IgA de las muestras de calostro normal.

Ya hemos descrito previamente los altos niveles de IgM en otra puerpera deficiente en IgA, lo cual pudiera representar un fenómeno de compensación por la deficiencia de IgA (Barros et al., 1985).

El IgA del calostro actúa como la opsonina para destruir EPEC por medio de fagocitos mononucleares del calostro

Debido a que el calostro humano contiene grandes cantidades de leucocitos viables, también estudiamos la habilidad de los fagocitos mononucleares para destruir EPEC son opsonizados. Aún cuando la función de opsonozación de los anticuerpos IgA es todavía controversial en la literatura, demostramos que el IgA purificado proveniente de muestras de calostro, puede opsonizar EPEC al inducir la destrucción de bacterias por fagocitos mononucleares del calostro (Honorio-Franca et al., 1997). Se redujo el efecto opsonizante del calostro deficiente en IgA de manera importante mientras que el mismo calostro deficiente en IgG y en C3, mantuvo su habilidad opsonizante. La actividad opsonizante de los anticuerpos IgA se eliminó cuando las células mononucleares fueron incubadas con anterioridad con un anticuerpo monoclonal IgM (My43) contra receptores alfa Fe.

La destrucción de bacterias por medio de fagocitos mononucleares del calostro después de la opsonozación por medio de SigA pudiera representar un mecanismo adicional de protección por lactancia materna en contra de infecciones intestinales durante la primer semana de vida. También pudiera actuar como un mecanismo de control en contra de la colonización microbial del intestino neonatal durante el periodo prenatal.

A  partir de estas observaciones, podemos concluir que los mecanismos principales de la protección mediante la IgA de la leche humana, en contra de infecciones causadas diarreicas por E. Coli, son las siguientes:

Estos datos apoyan la relevancia de las prácticas de amamantar para mejorar las condiciones de salud de los infantes, especialmente aquellos viviendo bajo condiciones de mala higiene y salud en los países en vías de desarrollo.

Reconocimientos

Quisiera agradecer a mis colegas: Dra, Solagne B. Carbonare, Dra. Aparecida T. Nagao, Dra. Adelina Honório Franca, Dra. Ivana Louroiro, Dra. Rocelice Fernández, Marcia T. Delneri, Patricia Palmeira, Dra. Sonia Ramos, Dr. Gad Frankel y al Profesor Dr. Luis R. Trabulsi. Este trabajo ha sido apoyado por FAPESP (Fundación de Amparo a Pesquisa de Estado de Sao Paolo) y por el CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimiento Científico e Tecnológico).

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